灵芝（Ganoderma lucidum）是一种属于担子菌门多孔菌科的药用真菌，是一种具有免疫调节、抗衰老和延年益寿作用的珍贵中药材。灵芝的活性成分主要包括灵芝多糖（GLP）、蛋白质、三萜类和麦角甾醇。G. lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst、Ganoderma japonium和鹿角灵芝（Ganoderma amboinense）是三种最常见的灵芝，先前的研究表明，GLP和三萜类化合物是灵芝的主要活性成分。从灵芝孢子粉中纯化的GLP由葡萄糖和半乳糖组成，50～400 μg/mL的GLP可以促进脾脏淋巴细胞的增殖。研究人员观察到，GLP的分子量分布为80～200 kDa。有研究用灵芝多糖给小鼠灌胃，观察到灵芝多糖可以提高小鼠的免疫能力，并有较强的抗氧化作用。此外，有报道研究了GLP对A549肺癌细胞增殖的抑制作用，观察到顺铂联合GLP对A549细胞增殖有较强的抑制作用。 

到目前为止，关于灵芝子实体和孢子粉多糖的免疫增强活性、抗氧化活性、抗肿瘤活性和细胞保护作用的研究已经非常深入，但关于灵芝菌丝体多糖（GAMPS）及其对细胞的保护作用以及伤口愈合作用的研究却鲜有报道。通过深层液体发酵生产的灵芝菌丝体胞内多糖具有产量高、质量稳定、生产周期短、成本低等优点。山东农业科学院农产品研究所的Shuangzhi Zhao、Jinyu Yang、Leilei Chen等在本研究以液体发酵获得的GAMPS为基础，分析了GAMPS的单糖组成和分子量分布，同时分析了其生物活性，如细胞增殖、细胞伤口愈合效果和抗氧化活性。具体来说，通过高效液相色谱法（HPLC）和高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）分别对GAMPS进行了高效提取，并分析了其单糖组成和分子量分布。此外，在细胞水平上研究了其促进THP-1细胞增殖的能力和对NIH/3T3细胞的划痕损伤修复能力。最后，通过研究GAMPS的氧自由基吸收能力（ORAC），探讨了其促进正常细胞增殖和修复细胞损伤的机制。该研究为GAMPS的进一步开发和利用提供了理论基础。

结论和讨论

GAMPS的单糖组成

酸解后的PMP衍生物通过HPLC检测，得到GAMPS的单糖组成和摩尔百分比。如表1所示，GAMPS主要由Glc、Man和Gal组成，摩尔比为67.62∶14.07∶7.50，这与之前报道的GLP的单糖组成不同。由于灵芝的种类不同，它们在单糖组成和其他理化性质上的差异可能与它们的特定功能密切相关。因此，对GAMPS的深入研究具有重要意义。 

表1  GAMPS的糖基组成

GAMPS的分子量分布

分子量是多糖的一个重要理化指标，不同多糖来源的多糖分子量分布通常不同。通过HPGPC-渗透色谱-多角度激光散射（HPGPC-MALS）分析来确定GAMPS的分子量分布。如图1所示，尽管在微分光谱上形成了多个吸收峰，但GAMPS的分子量分布却集中在激光散射光谱的两个峰上。此外，表2中列出了重量平均相对分子量（Mw）和数量平均相对分子量（Mn）。GAMPS的Mw分布为5.439×10⁶ g/mol和1.704×10⁵ g/mol，表明GAMPS大多以高分子量的多糖存在。峰1的累积分布为13.8%，峰2为80.7%。 

图1  GAMPS的HPGPC-MALS结果 

表2  GAMPS的分子量

GAMPS对正常细胞的增殖能力

水溶性GLP的活性在一定程度上与分子量分布相关。高分子量的GLP通常具有更多的生物活性。一般来说，活性GLP的分子量大于1.0×10⁴ g/mol，否则，活性很低甚至没有活性。在本研究中，通过水提取和醇沉法得到的GAMPS为高分子量多糖，分子量分别为5.439×10⁶ g/mol和1.704×10⁵ g/mol，这为GAMPS的促进细胞增殖活性提供了可能。为了评估GAMPS对正常细胞的增殖活性，用一系列浓度梯度的多糖溶液处理4种正常细胞（293 T/17、HUv-EC-C、NIH/3T3和THP-1）。如图2所示，0.02～0.2 μg/μL的GAMPS可以明显促进这4个细胞的增殖。在GAMPS浓度为0.1 μg/μL时，对NIH/3T3的增殖能力最强，细胞存活率为141.0%。在0.2 μg/μL的浓度下，对HUV-EC-C、THP-1和293 T/17的增殖能力最强，细胞存活率分别为144.9%、178.7%和157.8%。随着GAMPS浓度的增加，HUV-EC-C、THP-1和293 T/17的存活率明显增加，其中对THP-1的生长促进作用最好。这些结果表明，GAMPS对正常细胞具有增殖能力。 

A. NIH/3T3；B. HUV-EC-C；C. THP-1；D. 293 T/17。

图2  GAMPS处理正常细胞的存活率分析 

GAMPS对NIH/3T3的伤口愈合能力

为了研究GAMPS是否能促进NIH/3T3细胞的迁移，采用伤口愈合实验来探讨GAMPS（0.1 μg/μL）对NIH/3T3细胞划伤后迁移的影响。如图3所示，在无血清培养基中，NIH/3T3细胞受伤后开始迁移。当加入低浓度的GAMPS（0.1 μg/μL）后，24 h后缺口基本愈合；而PBS对照组的细胞在48 h后仍未过度生长。因此，低浓度的GAMPS（0.1 μg/μL）对促进NIH/3T3细胞的迁移和修复划痕损伤有作用。 

图3  GAMPS对成纤维细胞NIH/3T3的损伤修复作用

GAMPS的ORAC

为了评价GAMPS的ORAC，以PBS缓冲液为空白对照，Trolox为阳性对照，检测不同浓度GAMPS的荧光强度，并记录荧光衰减情况。计算不同浓度的GAMPS和Trolox的ORAC荧光淬灭曲线的积分面积AUC，得到GAMPS的ORAC的Trolox当量。如表3所示，GAMPS可以抑制自由基引起的荧光变化，且抑制能力随GAMPS浓度的增加而增强，说明GAMPS具有较强的ORAC。 

表3  GAMPS的ORAC

结论

在本研究中，采用深层液体发酵法获得灵芝菌丝体，采用水提取和醇沉法制备了GAMPS。经检测，GAMPS的分子量为5.439×10⁶ g/mol和1.704×10⁵ g/mol。此外，GAMPS由Glc、Man和Gal组成，摩尔比为67.62∶14.07∶7.50。浓度为0.02～0.2 μg/μL的GAMPS可以促进4种正常细胞的增殖，包括NIH/3T3、HUV-EC-C、THP-1和293 T/17。同时，0.1 μg/μL的GAMPS对成纤维细胞NIH/3T3显示出较高的伤口愈合活性。GAMPS的ORAC表明，它具有很强的抗氧化活性。该研究为GAMPS的开发和利用提供了理论依据。

The normal cell proliferation and wound healing effect of polysaccharides from Ganoderma amboinense

Shuangzhi Zhao^a,b, Ming Lei^c, Hui Xu^a, Hailun He^c, Alexander Suvorov^a, Junhua Wang^a, Jiying Qiu^a, Qingxin Zhou^a, Jinyu Yang^a,*, Leilei Chen^a,*

^a Institute of Agro-Food Science and Technology, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology of Shandong Province/Key Laboratory of Novel Food Resources Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Jinan 250100, China

^b College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China

^c School of Life Science, Central South University, Changsha 410013, China

*Corresponding authors.

E-mail address: yangjinyu86@163.com

chenleilei8210@163.com

Abstract

To study the cell proliferation and wound healing activity of polysaccharides from Ganoderma amboinense (GAMPS), the polysaccharide was extracted by water extraction and alcohol precipitation method, and its monosaccharide composition and molecular weight were analyzed. The effects of different concentrations of GAMPS on the cell proliferation were determined by cell survival rate test, and the wound healing ability of GAMPS to NIH/3T3 cells was detected. The preliminary evaluation of the antioxidant ability of GAMPS was conducted by the oxygen radical absorbance capacity (ORAC). The results showed that the GAMPS was composed of glucose, mannose, and galactose at a molar ratio of 67.62:14.07:7.50, and the weight-average molecular weights were 5.439 × 10⁶ and 1.704 × 10⁵ g/mol by using high-performance gel-permeation chromatography-multiple angle laser scatter (HPGPC-MALS) analysis. GAMPS (0.2 μg/μL) showed the strongest proliferation ability to THP-1 cells, with cell survival rate of 178.7%. The wound healing effect of GAMPS (0.1 μg/μL) was obvious on NIH/3T3 and 3.75 μg/μL of GAMPS showed the strongest total antioxidant ability. All the results indicate that GAMPS promotes cell proliferation, and has cell wound healing effect and strong antioxidant activity. The results provide theoretical foundation for the development and utilization of GAMPS.

Reference:

ZHAO S Z, LEI M, XU H, et al. The normal cell proliferation and wound healing effect of polysaccharides from Ganoderma amboinense[J]. Food Science and Human Wellness, 2021, 10(4): 508-513. DOI:10.1016/j.fshw.2021.04.013.

（来源：食品科学与人类健康）